＋酸性或阳性反应；－碱性或阴性反应；＋／－多数阳性少数阴性
上表中反应序号１，２，３的反应结果，应作为沙门氏菌疑似菌株继续鉴定。其它反应结果可不作为沙门氏菌疑似菌株而加以排除。对有疑问的菌株，可补做乳糖、蔗糖发酵及氧化酶试验，沙门氏菌均应为阴性反应。
取疑似菌株的ＴＳＩ琼脂斜面或肉汤琼脂斜面３６±１℃１８～２４小时的培养物，涂片作革兰氏染色，镜检。沙门氏菌应为革氏阴性杆菌。
３．５ 生化反应 取沙门氏菌疑似菌株的ＴＳＩ斜面培养物，作以下试验：
３．５．１ 靛基质试验 用接种环沾取少量培养物，接种至蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检验方法项下操作、判断结果。沙门氏菌应为阴性反应。
３．５．２ 尿素酶试验 用接种环沾取培养物，划线接种于尿素琼脂培养基上。置３６±１℃培养２４小时，观察结果。如斜面变为红色为阳性反应；阴性反应不变色。沙门氏菌应为阴性反应。
３．５．３ 氰化钾试验 取３６±１℃培养２０～２４小时的疑似菌株肉汤培养液，用接种环沾取１环，接种至氰化钾培养基内，另取一环接种于对照培养基内。接种后即以橡胶塞塞紧，置３６±１℃培养２４～４８小时，观察结果，对照管内有菌生长（混浊），而试验管也有菌生长者为阳性（不受抑制）。经４８小时培养后，对照管有菌生长，而试验管无细菌生长时为阴性（受抑制）。沙门氏菌应为阴性反应。
本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在水浴中进行，以防氰化钾分解。产生氢氰酸逸出，致使氰化钾浓度下降，细菌生长，造成假阳性。
３．５．４ 赖氨酸脱羧酶试验 用接种环沾取少量培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种对照培养基。置３６±１℃培养２４～４８小时，观察结果。对照管黄色，试验管呈紫色时为阳性反应（赖氨酸脱羧产碱）；黄色为阴性反应。沙门氏菌应为阳性反应。
表５： 沙门氏菌与有关细菌生化反应初步鉴别
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｜序 号｜硫化氢｜靛基质｜尿素酶｜氰化钾｜赖氨酸｜ 可能的菌属 ｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜脱羧酶｜ ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－｜
｜ １ ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ － ｜ ＋ ｜沙门氏菌属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ２ ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ＋ ｜沙门氏菌属（少见） ｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜爱德华氏菌属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ｜ － ｜ － ｜ － ｜ － ｜ ＋ ｜沙门氏菌属、埃希氏菌属 ｜
｜ ３ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜甲型副伤寒沙门氏菌 ｜
｜ ｜ － ｜ － ｜ － ｜ － ｜ － ｜埃希氏菌属、志贺氏菌属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ４ ｜ ＋ ｜ － ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜柠檬酸杆菌属、奇异变形杆菌｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ５ ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜普通变形杆菌 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ６ ｜ － ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ＋ ｜埃希氏菌属 ｜
｜ ｜ － ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ － ｜埃希氏菌属、志贺氏菌属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ７ ｜ － ｜ － ｜＋／－｜ ＋ ｜ ＋ ｜克雷伯菌族各属 ｜
｜ ｜ － ｜ － ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜阴沟肠杆菌、柠檬酸杆菌属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ８ ｜ － ｜ ＋ ｜＋／－｜ ＋ ｜ － ｜摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属｜
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注：（１）硫化氢试验以ＴＳＩ培养基结果为准
（２）＋表示阳性；－表示阴性；＋／－表示多数阳性，少数阴性。
上述反应序号１，２，３可能为沙门氏菌，其它５种反应结果可以排除沙门氏菌。
反应序号１为沙门氏菌属典型反应。其中若靛基质反应阳性（反应序号２），应补做甘露醇和山梨醇发酸试验，沙门氏菌皆为阳性反应。若尿素酶、氰化钾及赖氨酸脱羧酶３项试验中有１项异常时，仍应作为沙门氏菌疑似菌株，继续鉴定；若有２项异常，可排除沙门氏菌。
反应序号３者应排除ＴＳＩ斜面产酸的菌株，结合动力试验阳性。作为沙门氏菌疑似菌株继续鉴定。
３．６ 动力检查 用接种针沾取培养物，穿刺接种半固体肉汤琼脂管，置３６±１℃培养２４小时，观察结果。有动力的细菌能运动到穿刺线外呈四周扩散生长，使培养基呈现混浊蔓延现象；无动力的细菌仅没穿刺线生长，周围培养基清晰。无动力表现的培养物，应在室温保留２～３天后，再观察。沙门氏菌除少数例外，均具有周身鞭毛，能运动。
３．７ 血清学试验 在洁净载玻片近中心区的一端，以接种环沾取沙门氏菌属Ａ～Ｆ“０”多价血清２～３环，再挑取疑似菌株的ＴＳＩ斜面上部的培养物少许，与血清混合（要小心操作，以防外溅，污染四周），将玻片前后侧动，在暗背景下观察结果。如为阳性反应，通常在３分钟内出现凝集现象。有时反应迟缓，需将玻片置培养皿内，并在皿内放湿棉球１个，以防干涸，约过２０分钟，再观察结果。
凡与血清出现凝集者，应以生理盐水与同一菌株培养物作对照试验。对照应无凝集现象方可确定为阳性反应。
当与血清未出现凝集时，应以接种环取上述斜面培养物，置于含少量生理盐水的试管中，制成浓菌悬液，在１００℃水浴中保温３０分钟，待冷，再以此处理后的菌悬液与沙门氏菌属Ａ～Ａ“０”多价血清作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性反应；如不出现凝集，则为阴性反应。
４．结果报告及处理 凡疑似菌株培养物①生化试验及血清学试验结果按表６情况报告结果或提出进一步鉴定意见。
注① 疑似菌培养物系指ＴＳＩ琼脂斜面反应序号为１，２，３，的培养物。
表６：
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｜ ｜ 血清凝集试验 ｜ ｜ ｜
｜ ｜ （Ａ～Ｆ“０”血清） ｜ ｜ ｜
｜序｜－－－－－－－－－－－－－－－｜生化反应＊｜ 报告或处理意见 ｜
｜号｜凝集｜１００℃３０分钟｜生理盐｜ ｜ ｜
｜ ｜反应｜ 凝集反应 ｜水对照｜ ｜ ｜
｜－｜－－｜－－－－－－－－｜－－－｜－－－－－｜－－－－－－－－－－｜
｜１｜＋ ｜ ｜ － ｜ 符合 ｜ 检出沙门氏菌 ｜
｜２｜－ ｜ ＋ ｜ － ｜ 符合 ｜ 检出沙门氏菌 ｜
｜３｜－ ｜ － ｜ ｜ 不符合 ｜ 未检出沙门氏菌 ｜
｜４｜＋ ｜ ｜ － ｜ 不符合 ｜ 进一步鉴定 ｜
｜５｜－ ｜ ＋ ｜ － ｜ 不符合 ｜ 进一步鉴定 ｜
｜６｜－ ｜ － ｜ ｜ 符合 ｜ 进一步鉴定 ｜
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＊生化反应符合系指生化反应序号１，２（甘露醇及山梨醇均为阳性）及３（乳糖、蔗糖应为阴性，动力应为阳性）的初步鉴别试验结果；不符合系指反应序号４、５、６、７、８的鉴别结果。
绿脓杆菌检验法
绿脓杆菌为假单胞菌属细菌，学名为铜绿色假单胞菌。本菌对人类有致病力，并对许多药物具有天然的耐药性。烧伤、烫伤、眼科疾患和其他外伤，常因绿脓杆菌引起继发感染，是常见的化脓性感染菌，可造成眼角膜溃疡、失明，引起败血症等严重病患。本菌在自然界分布广泛，土壤、空气、水以及人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在。故可通过生产的各个环节污染药品。因此，一般眼科用制剂和外用药品，规定不得检出绿脓杆菌。
１．培养基、试剂
１．１ 普通肉汤培养基（附录三１）
１．２ 十六烷三甲基溴化铵琼脂（附录三２２）
１．３ 普通肉汤琼脂斜面（附录三２）
１．４ ＰＤＰ琼脂斜面（附录２３）
１．５ 明胶培养基（附录２４）
１．６ 硝酸盐胨水培养基（附录三２５）
１．７ １％盐酸二甲基对苯二胺液（附录二４）
１．８ ＨＣＩ（１ｍｏｌ／Ｌ）（附录二４）
１．９ 氯仿
２．检验程序
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｜供试品｜
－－－－－
｜
－－－－－
｜供试液｜
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｜
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｜胆盐乳糖增菌液｜
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３６±１℃ ｜１８～２４小时
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｜十六烷二甲基溴化铵平板｜
－－－－－－－－－－－－－
３６±１℃ ｜１８～２４小时
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｜普通肉汤琼脂斜面｜
－－－－－－－－－－
３６±１℃ ｜１８～２４小时
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｜ ｜
－－－－－－－－－ －－－－－－－
｜革兰氏染色镜检｜ ｜氧化酶试验｜
－－－－－－－－－ －－－－－－－
｜
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阳性 ｜ ｜阴性
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｜绿脓菌素试验｜ ｜报告｜
－－－－－－－－ －－－－
｜
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阴性 ｜ ｜阳性
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｜ ｜ ｜报告｜
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｜明胶液化｜ ｜硝酸盐还原｜ ｜４２℃生长｜
｜ 试验 ｜ ｜产气试验 ｜ ｜ 试 验 ｜
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｜ ｜ ｜
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｜
－－－－
｜报告｜
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３．操作步骤
３．１ 增菌培养
取供试液（总则５）１０ｍｌ，接种于１００ｍｌ胆盐乳糖增菌液中（滴眼剂可接种于普通肉汤中），置３６±１℃培养１８～２４小时。如有绿脓杆菌生长，培养液变混，液面多有１层菌膜，表层常呈黄绿或蓝绿色。
含有抑菌成分的滴眼剂等液体制剂，可取供试品２ｍｌ，用薄膜过滤法（总则５．３．２）过滤并冲洗滤膜，将滤膜剪成２片，分置于２瓶１００ｍｌ胆盐乳糖增菌液或（或普通肉汤）中（与金黄色葡萄球菌同时检验时，取样４ｍｌ，过滤后剪成４片，分置于二种增菌液４瓶中），其中１瓶加入规定量的对照菌作阳性对照。置３６±１℃培养１８～２４小时。
３．２ 分离培养 以接种环沾取增菌培养液（如有菌膜，应挑取之），划线于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，于３６±１℃培养１８～２４小时。
绿脓杆茵在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上的典型菌落为扁平无定形，边缘不齐，周边呈扩散现象，常互相融合，表面湿润、无光泽、呈灰白色。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色。但亦有不产色素的菌株，菌落亦有粗糙型和侏儒型等。应注意挑选。
分离平板若无菌落生长，可作出“未检出”报告。若生长，以接种针沾取２～３个疑似菌落培养物分别接种至肉汤琼脂斜面上，３６±１℃培养１８～２４小时。
３．３ 革兰氏染色镜检 取普通肉汤琼脂斜面培养物，涂片、革兰氏染色，镜检。绿脓杆菌为革兰氏阴性、无芽孢杆菌，菌体长短不一，可呈多形性排列、成双或短链状。本菌体一端有１根鞭毛，以活体观察，可见活泼动力，以鞭毛染色法（附录二、１２）可见单端鞭毛。
３．４ 生化试验
３．４．１ 氧化酶试验 取一小块白色洁净的滤纸片置平皿内，以无菌玻璃棒挑取肉汤琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸片上，随即滴加１滴新配制的１％盐酸二甲基对苯二胺试剂，在３０秒钟内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，氧化酶试验为阳性，可作出未检出绿脓杆菌报告。
３．４．２ 绿脓菌素试验 取肉汤琼脂斜面培养物，接种在测定绿脓菌色素用的ＰＤＰ琼脂斜面上，置３６±１℃培养２４小时后，在试管内加氯仿３～５ｍｌ，搅碎并充分振摇，使培养物中的色素提取在氯仿液内。待氯仿提取液呈蓝绿色时，用毛细管将其移至另一试管中，并在该液中加盐酸液（１ｍｏｌ／Ｌ）约１ｍｌ，振摇后，静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色，即为阳性；无粉红色出现，为阴性反应。对阴性反应的培养物，应再接种ＰＤＰ琼脂斜面，置３６±１℃培养２～３天后，再行检查。
凡氧化酶试验阳性、绿脓菌素阳性及革兰氏阴性杆菌的培养物，可作出检出绿脓杆菌的报告。
上述试验结果中，绿脓菌素阴性反应的培养物，应继续进行以下试验。
３．４．３ 硝酸盐还原产气试验 以接种环沾取普通肉汤琼脂斜面培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置３６±１℃培养２４小时，观察结果。如在培养基的小倒管中有气体产生，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
３．４．４ ４２℃生长试验 以接种环挑取普通肉汤琼脂斜面培养物于灭菌盐水中，制成菌悬液，然后取菌悬液接种于肉汤琼脂斜面上，立即置４１±１℃水浴箱中培养２４～４８小时，斜面若有菌苔生长者为阳性；反之为阴性。
３．４．５ 明胶液化试验 以接种针沾取普通肉汤琼脂斜面培养物，穿刺接种于明胶培养基内，置３６±１℃培养２４小时，取出放冰箱内１０～３０分钟。如培养基仍呈溶液状，即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者，为阴性反应。
